FC實(shí)驗步驟

一、細胞表面染色操作流程

1、細胞計數：將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數；500g離心4min，去上清；

2、制備單細胞懸液：將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個(gè)細胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細胞懸液；

3、(可選)阻斷Fc受體：室溫孵育10-20min；

4、一抗孵育：每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應30min；

5、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍；

6、二抗孵育：對于非熒光染料直標抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟8；

7、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍；

8、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。

二、細胞胞內染色操作流程

1、細胞計數：將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數；500g離心4min，去上清；

2、制備單細胞懸液：將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個(gè)細胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細胞懸液，400g離心5min去上清；

3、固定：每孔加入100μl細胞固定劑重懸細胞，2-8°孵育20min；

4、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍；

5、通透：每孔加入100μl細胞通透劑重懸細胞，室溫孵育20min；

6、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍；

7、(可選）阻斷Fc受體：10-20min；

8、一抗孵育：每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應30min；

9、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍；

10、二抗孵育：對于非熒光染料直標抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟11；

11、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍；

12、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。